Menu dodatkowe
Menu strony
Ścieżka nawigacyjna
Ikony społecznościowe
Treść strony
Kwarantannowy nicień – węgorek sosnowiec (Bursaphelenchus xylophilus)
Podsumowanie wyników badań prowadzonych w roku 2024
D.C. Zadanie 1.2. Optymalizacja metod wykrywania, monitorowania i zwalczania kwarantannowego nicienia węgorka sosnowca (Bursaphelenchus xylophilus) oraz jego wektora – żerdzianki sosnówki (Monochamus galloprovincialis) w warunkach środowiskowych Polski
Marek Tomalak i Anna Filipiak, Zakład Metod Biologicznych, IOR-PIB
Głównym celem badań przeprowadzonych w ramach zadania D.C. 1.2., w roku 2024, było poszukiwanie i testowanie nowych rozwiązań zwiększających skuteczność, szybkość i wiarygodność metod wykrywania, monitorowania i zwalczania węgorka sosnowca (B. xylophilus) oraz jego wektorów. W uzupełnieniu niezbędne było przeprowadzenie szeregu wyjaśniających badań podstawowych z zakresu genetyki, morfologii i bionomii tego nicienia oraz jego wektora – żerdzianki sosnówki.
Prowadzone badania obejmowały prace terenowe i laboratoryjne. Przeanalizowano ponad 160 prób drewna sosny zasiedlonej przez żerdziankę sosnówkę i okazjonalnie przez inne saproksylofagi, oraz chrząszczy tych owadów odłowionych do pułapek feromonowych, lub wyhodowanych z materiału lęgowego. Spośród nicieni z rodzaju Bursaphelenchus najczęściej wykrywano nieszkodliwy, rodzimy gatunek B. mucronatus, który jest najbardziej zbliżony genetycznie, morfologicznie i bionomicznie do kwarantannowego B. xylophilus. Wykazano również częste występowanie B. piniperdae i sporadyczne B. pinophilus oraz B. fraudulentus. W badanych próbach drewna i chrząszczy żerdzianki nie wykryto obecności kwarantannowego, patogenicznego dla sosny węgorka sosnowca (B. xylophilus).
W roku 2024 przeprowadzono szczegółowe badania nad izolowaną z drewna sosny w Nadleśnictwie Turek, nową populacją nicienia z rodzaju Bursaphelenchus, morfologicznie zbliżoną do hybryd międzygatunkowych pomiędzy B. mucronatus i B. xylophilus (tj. u części samic zakończenie ogona w formie różnej długości, szerokiego stożka). Alarmującym dla Nadleśnictwa i regionalnego Zespołu Ochrony Lasu było grupowe zamieranie drzew sosny, w których występował ten nicień. Nasze szczegółowe badania molekularne i bionomiczne wykazały, że był to morfologicznie nietypowy, niepatogeniczny B. mucronatus, a zamieranie drzew spowodowane zostało nadmiernym przesuszeniem gleby oraz wtórnym zasiedleniem osłabionych drzew przez tycza mniejszego (Acanthocinus griseus).
W bieżącym roku prowadzono również prace nad charakterystykami nowego izolatu Bursaphelenchus xylophilus Jining-01, wykrytego przez służby graniczne PIORiN, w drewnianych materiałach opakowaniowych (DMO), importowanym z Chin. Morfologicznie nicień ten zbliżony jest do innego „standardowego” szczepu chińskiego Nanjing. Charakteryzuje się szeroko zaokrąglonym zakończeniem ogona samicy w hodowli in vitro i wyraźnym mukronem występującym na zakończeniu ogona u ok. 70% samic z hodowli in vivo, w siewkach sosny. W badaniach in vitro (w 10 cm płytce Petri’go, na podłożu B. cinerea/PDA) nowy izolat Jining-01 wykazał bardzo wysoką zdolność reprodukcji in vitro, na B. cinerea/PDA. Inokulum wielkości ok. 30 osobników dorosłych (samic i samców) w ciągu 14 dni hodowli w temperaturze ok. 22oC osiągnęło liczebność ok. 7-10 tys. osobników różnych stadiów rozwojowych, przy zachowaniu wysokiego wigoru i aktywności ruchowej.
Pilotażowe badania rozwoju populacji i patogeniczności w stosunku do 4-letnich siewek sosny wykazały również wysoką patogeniczność nowego izolatu. Już w ciągu 30 dni około 1000 osobników Jining-01 inokulowanych do strzałki drzewek licznie się rozmnażało i zabijało drzewka, gdy, zaś dla szczepu Nanjing zajmowało to ponad 2 miesiące. Szczególnie interesujące okazało się porównanie patogeniczności uzyskanych przez nas hybryd wewnątrzgatunkowych B. xylophilus Jining x Nanjing w siewkach sosny. Hybrydy zabijały siewki o ok. 20 dni później niż rodzicielski izolat Jining, lecz o 10-20 dni wcześniej niż szczep Nanjing.
W ramach prac nad zwiększeniem precyzji identyfikacji B. xylophilus oraz rodzimego B. mucronatus kontynuowano badania nad wiarygodnością metody morfologicznej, szeroko wykorzystywanej przez służby fitosanitarne na świecie. Dzięki włączeniu do prac hybrydyzacyjnych (wewnątrzgatunkowych) szczepów B. xylophilus charakteryzujących się stałą obecnością szeroko zaokrąglonego zakończenia ogona samicy (Pt67OL i Roll-01), z których drugi zawiera również markerową mutację Bxy-rol(tom3) (Tomalak i Filipiak, 2019), oraz innych populacji tego gatunku (US10 i Nanjing, Jining-01), które podobnie, jak nieszkodliwy B. mucronatus posiadają mukron na końcu ogona samic, przeprowadzono serię krzyżowań diallelicznych i ocenę fenotypów powstających w potomstwie. Istotną różnicą pomiędzy tymi szczepami/izolatami jest obecność mukrona w potomstwie uzyskanym zarówno z hodowli in vivo, jak i in vitro (US10), lub tylko w potomstwie uzyskanym z hodowli in vivo (Nanjing i Jining-01). Nowy izolat Jining-01, wykryty na początku roku 2024 przez służby graniczne PIORiN, w DMO importowanym z Chin, został włączony do naszych prac hybrydyzacyjnych ze względu na swoje naturalne pochodzenie z masowej reprodukcji w drewnie, bez dodatkowych cykli rozwojowych w zawężonej populacji laboratoryjnej hodowanej in vitro, co pozwala na uniknięcie potencjalnego wpływu dryftu genetycznego i ograniczenia naturalnej zmienności. Izolat ten stanowi doskonały materiał porównawczy dla zbliżonego, standardowego szczepu Nanjing, utrzymywanego na świecie w laboratoryjnych hodowlach in vitro już od ponad 20 lat. W wariantach porównawczych uwzględniano charakter i segregację fenotypów hybryd rozwijających się w kulturach in vitro, na podłożu Botrytis cinerea/PDA oraz in vivo w 4-letnich siewkach sosny zwyczajnej.
Przeprowadzone badania jednoznacznie wskazały na genetyczny charakter uwarunkowań obecności/braku mukrona na ogonie samic węgorka sosnowca (B. xylophilus), umożliwiający łatwy transfer obu wariantów tej cechy w obrębie gatunku B. xylophilus. Prace te w znacznym stopniu wyjaśniły również mechanizmy dziedziczenia omawianej cechy, które istotnie różną się pomiędzy szczepem amerykańskim (US10), gdzie fenotyp z mukronem występuje zarówno w warunkach in vivo, jak i in vitro oraz chińskimi, gdzie fenotyp z mukronem widoczny jest tylko w populacjach rozwijających się in vivo, w siewkach sosny. Istotne dla praktyki są również nasze dotychczasowe wyniki spontanicznego krzyżowania szczepu B. xylophilus z mukronem (US10) z pozbawionym mukrona Roll-01, zawierającym wykrytą przez nas wcześniej markerową mutację Bxy-rol(tom3). Wskazują one, że cecha „nietypowej” obecności mukrona raz wprowadzona na drodze krzyżowania wewnątrzgatunkowego do pozbawionej mukrona populacji B. xylophilus, pozostaje w niej, stopniowo rozprzestrzeniając się w nowych pokoleniach hybryd. Zależności wykryte w naszych obecnych badaniach ograniczają możliwości wiarygodnego odróżnienia B. xylophilus od B. mucronatus na podstawie morfologii. Opinia ta potwierdzona została również przez wyniki naszych obecnych badań nad zmiennością genetyczną i morfologiczną w obrębie rodzimych populacji B. mucronatus, gdzie wielkość i kształt mukrona prezentują znaczną zmienność, częściowo nakładającą się na zmienność obserwowaną u B. xylophilus (Tomalak i Filipiak, 2024).
W bieżącym okresie sprawozdawczym przeprowadzono badania dotyczące metod identyfikacji pozwalającej odróżnić żywe osobniki węgorka sosnowca od martwych. Identyfikacja taka jest szczególnie ważna podczas rutynowej, granicznej kontroli fitosanitarnej opakowań drewnianych wwożonych na teren Unii Europejskiej. Wcześniejszy, dobrze przeprowadzony zabieg termiczny takich opakowań (zgodnie z obowiązującymi przepisami fitosanitarnymi: ISPM nr 15; FAO 2009) pozwala na skuteczne zabicie wszelkich obecnych w nich organizmów żywych (w tym nicieni). Jednakże, zdarzają się przypadki nieskutecznego wykonania zabiegu lub też wręcz fałszowania oznakowania. W przypadku obecności w drewnie martwych osobników nicienia pozostałych po przeprowadzeniu skutecznego zabiegu termicznego, analiza molekularna przeprowadzona na podstawie DNA tych nicieni może dać fałszywe wyniki pozytywne (DNA nicieni jest obecne zarówno w osobnikach żywych, jak i martwych). Lepszym rozwiązaniem podczas przeprowadzania analizy molekularnej nicieni występujących w drewnie poddanym zabiegom termicznym jest jej wykonanie na podstawie wyizolowanego RNA nicieni (RNA jest obecny w żywych komórkach i szybko ulega degradacji w komórkach martwych).
Tegoroczne badania przeprowadzano na podstawie opracowanej wcześniej techniki molekularnej PCR z wykorzystaniem RNA (Leal i in., 2013). RNA węgorka sosnowca izolowano z prób zawierających różną liczbę (od 1 do 100) jego martwych lub żywych osobników. Wyniki przeprowadzonych analiz wykazały obecność RNA węgorka sosnowca zarówno w żywych, jak, i przez kilkudniowy okres po zabiegu, w osobnikach martwych. Podczas tej samej reakcji PCR, otrzymywano również produkty dla DNA B. xylophilus o innej długości, co w łatwy sposób umożliwiło odróżnienie RNA od DNA tego gatunku nicienia.
Wykonane zostały również doświadczenia określające szybkość zanikania RNA w martwych nicieniach. Wykonane analizy wykazały możliwość wykrywania RNA w martwych osobnikach węgorka sosnowca do 5 dni po obróbce termicznej. Wszystkie próby analizowane po 10 dniach od takiej obróbki wykazały całkowity brak RNA w badanych nicieniach. Dodatkowo, przeprowadzono badania nad praktycznym wykrywaniem żywych i martwych nicieni węgorka sosnowca (w liczbie 100 i 500 osobników) bezpośrednio ekstrahowanych z drewna, które poddano zabiegowi obróbki cieplnej (56°C w rdzeniu materiału przez 30 min). Wykonana następnie analiza molekularna nicieni wyekstrahowanych z krążków traktowanego termicznie drewna potwierdziła prawidłowość przeprowadzonego zabiegu, gdyż w żadnym przypadku nie wykrywano nicieni. Badania te jednoznacznie wykazały, że analizowanie nicieni uzyskanych z drewnianych materiałów opakowaniowych na podstawie RNA nicieni jest bardziej wiarygodną metodą niż analiza ich DNA.
W bieżącym okresie sprawozdawczym przeprowadzono również potwierdzającą analizę molekularną nicieni wykrytych przez inspektorów PIORiN w przesyłce zawierającej drewniane materiały opakowaniowe (DMO), pochodzące z Chin. Analiza molekularna (reakcja PCR-RFLP oraz sekwencjonowanie) potwierdziła identyfikację tych nicieni, jako kwarantannowego gatunku B. xylophilus. Izolat ten (nazwany przez nas Jining-01) wykorzystany został dalej w opisanych wyżej badaniach nad charakterystykami tej populacji oraz dziedziczeniem mukrona u B. xylophilus.
W minionym okresie sprawozdawczym kontynuowano prace nad metodami wykrywania i identyfikacji hybryd międzygatunkowych powstających pomiędzy B. xylophilus i rodzimym, niepatogenicznym B. mucronatus, które w naturalnych warunkach mogą równocześnie zasiedlać sosnę. Populacje wybranych wsobnych linii rekombinacyjnych (RIL-01 i RIL-02) pochodzących z indywidualnego krzyżowania B. xylophilus x B. mucronatus, inokulowano do sosny, a następnie, po ekstrakcji z rośliny, sprawdzano ich status hybryd międzygatunkowych przy wykorzystaniu technik molekularnych. Obecność rozwijających się in vitro hybryd potwierdzano na podstawie analizy serii pojedynczych osobników dorosłych nicieni przy pomocy molekularnych testów PCR ze specyficznymi starterami (Filipiak i wsp. 2017). Przeprowadzone badania wykazały, że w pokoleniach F12/13 większość osobników obu serii wybranych linii wsobnych (RIL-01 i RIL-02) nadal prezentowało status hybryd międzygatunkowych, zawierających materiał genetyczny zarówno B. xylophilus, jak i B. mucronatus. Do tegorocznych badań nad hybrydyzacją międzygatunkową włączono również nową populację B. xylophilus (Jining-01). Nasze dotychczasowe wyniki badań molekularnych związanych z krzyżowaniem tej populacji z polskimi populacjami niepatogenicznego gatunku B. mucronatus wykazały, że część uzyskanych osobników potomnych pokolenia F2/F3 prezentowała status hybryd międzygatunkowych, zawierających materiał genetyczny zarówno B. xylophilus, jak i B. mucronatus. Wskazuje na skuteczne krzyżowanie się badanych populacji tych gatunków
Pozostałe wyniki naszych badań prowadzonych w bieżącym roku zostały opublikowane w dwóch artykułach zamieszczonych w międzynarodowych czasopismach naukowych, objętych klasyfikacją Impact Factor. Są to:
1. Filipiak, A. i Tomalak, M. (2024) Real-time PCR as a tool for detection and identification of Bursaphelenchus xylophilus and B. mucronatus based on trace amounts of their DNA left in the vector – the Pine Sawyer Beetle. Monochamus galloprovincialis. Journal of Applied Entomology 1-9, https://doi.org/10.1111/jen.13358 [Real-time PCR, jako narzędzie do wykrywania i identyfikacji Bursaphelenchus xylophilus oraz B. mucronatus na podstawie śladowych ilości ich DNA pozostawionych w owadzie-wektorze – żerdziance sosnówce (Monochamus galloprovincialis)]
2. Tomalak, M. i Filipiak, A. (2024). A natural intra-specific hybridization between populations of B. mucronatus with European and East Asian genotypes, in pine forests. Forest Pathology 54(3), e12868, https://doi.org/10.1111/efp.12868. [Naturalna hybrydyzacja wewnątrz-gatunkowa zachodząca w drzewostanach sosnowych pomiędzy populacjami Bursaphelenchus mucronatus prezentującymi genotyp europejski i wschodnioazjatycki]
1. Real-time PCR, jako narzędzie do wykrywania i identyfikacji Bursaphelenchus xylophilus oraz B. mucronatus na podstawie śladowych ilości ich DNA pozostawionych w owadzie-wektorze – żerdziance sosnówce (Monochamus galloprovincialis)
Możliwie wczesne wykrywanie obecności węgorka sosnowca (Bursaphelenchus xylophilus) w drzewostanie i natychmiastowe podejmowanie niezbędnych działań interwencyjnych może istotnie ograniczyć jego rozprzestrzenianie na nowo zasiedlanym obszarze. Wysoka czułość zastosowanych metod ma, więc, kapitalne znaczenie.
W badaniach wykorzystano chrząszcze żerdzianki sosnówki (Monochamus galloprovincialis), które były systematycznie odławiane do pułapek feromonowych IBL-3 z kompozycją atraktantów Galloprotect Pack, w Nadleśnictwie Wronki (Leśnictwo Mokrz). W celu ograniczenia możliwości ucieczki zwabionych owadów, niezbędne było dodanie do pojemnika zbiorczego ok. 250 ml glikolu, którego poziom systematycznie uzupełniano przez cały sezon badawczy. Zebrane chrząszcze były badane bezpośrednio po zbiorze (najwcześniej po 1-2 tygodni w glikolu), lub po dłuższym (do ok. 20 tygodni) przechowywaniu w glikolu, w temperaturze pokojowej. W związku z obserwowanym wcześniej stopniowym zmniejszaniem się częstotliwości występowania nicieni w chrząszczach żerdzianki w okresie ich lotu, badania te prowadzone były przez cały sezon, tj. od czerwca do października.
Po dysekcji martwych (w glikolu) owadów i wstępnej ocenie morfologicznej (stwierdzenie występowania nicieni - chrząszcze pozytywne lub ich braku – chrząszcze negatywne), uzyskane homogenaty z dysekcji pojedynczych owadów przenoszono do probówek Eppendorfa. Identyfikację nicieni występujących w żerdziankach przeprowadzano przy pomocy analizy molekularnej real-time PCR z zaprojektowanymi dla nich starterami uniwersalnymi i sondami specyficznymi (Filipiak i in., 2019). Każdorazowo, wykonywano także kontrolę pozytywną, w której stosowano odpowiednio DNA wyizolowane z hodowli laboratoryjnej węgorka sosnowca B. xylophilus (izolat Pt67-OL) i niepatogenicznego gatunku B. mucronatus (polski izolat Mdz-01).
Dysekcja chrząszczy wykazała, że największą liczbę owadów z nicieniami oraz liczbę nicieni w ich tchawkach stwierdzono na początku sezonu (czerwiec/lipiec). Natomiast, pod koniec sezonu (wrzesień/październik) chrząszcze z nicieniami spotykane były rzadko, lub sporadycznie – najczęściej odławiano chrząszcze bez nicieni.
Przeprowadzone badania molekularne przy pomocy reakcji real-time PCR potwierdziły występowanie w chrząszczach jedynie rodzimego, niepatogenicznego gatunku nicienia B. mucronatus. W żadnym przypadku badanych owadów nie stwierdzono w nich występowania kwarantannowego nicienia węgorka sosnowca. Dla kontroli odczynnikowej również nie otrzymywano żadnych produktów amplifikacji. Co istotne, zastosowana, molekularna technika real-time PCR zawsze potwierdzała obecność gatunku B. mucronatus w przypadku fizycznej obecności larw nicieni w ciele sekcjonowanych chrząszczy (tchawki) (Rys. 1). Jednakże, brak nicieni w sekcjonowanych chrząszczach na początku sezonu zawsze dawał negatywny wynik reakcji (Rys. 2), gdy zaś pod koniec sezonu real-time PCR materiału ekstrahowanego z chrząszczy pozbawionych nicieni generował wynik negatywny (Rys. 3), lub pozytywny (Rys. 4). Otrzymany tutaj pozytywny wynik reakcji może świadczyć o wcześniejszej obecności nicieni w badanych owadach, które w trakcie żeru dojrzewającego i/lub składania jaj przez wektora opuściły jego ciało, a pozostawione śladowe resztki ich kutikuli, lub innych fragmentów generowały pozytywny wynik.
Uzyskane wyniki badań potwierdziły wysoką skuteczność zastosowanej metody molekularnej real-time PCR do równoczesnego wykrywania i identyfikacji nicieni mogących jednocześnie występować w chrząszczach żerdzianki, tj. kwarantannowego nicienia węgorka sosnowca oraz powszechnie występującego na terenie Polski niepatogenicznego gatunku B. mucronatus. Zastosowana metoda diagnostyczna wykazała wysoką czułość umożliwiającą wykrywanie nawet resztek nicieni (np. kutikuli) wcześniej występujących w tchawkach owada wektora.
W przypadku wykrywania rodzimego, niepatogenicznego gatunku B. mucronatus, uzyskane wyniki mogą nie mieć istotnego znaczenia praktycznego. Jednakże, gdyby w badanych próbach wykryto takie śladowe ilości DNA węgorka sosnowca (B. xylophilus), wyniki te wskazywałyby jednoznacznie na obecność tego szkodnika w badanym drzewostanie i wymagałyby natychmiastowych, radykalnych środków kontroli. Przeprowadzone badania mają duże znaczenie dla wczesnego wykrywania nicieni obecnych w owadach odłowionych do pułapek feromonowych, co jest zadaniem znacznie łatwiejszym niż znalezienie drzew zainfekowanych węgorkiem sosnowcem jeszcze przed wylotem ich wektorów z żerowisk. Sytuacja taka byłaby szczególnie trudna na obszarach (w tym Polski), gdzie pojawienie się objawów choroby drzew mogłoby być znacznie opóźnione i ich wykrycie możliwe już po wylocie chrząszczy-wektorów z opanowanych drzew.
W przeprowadzonych badaniach wykorzystano technikę real-time PCR, która została włączona przez EPPO do protokołu diagnostycznego: „EPPO. 2023. PM 7/4
(4) Bursaphelenchus xylophilus. EPPO Bulletin, 53, 156–183”, jako jeden ze standardów diagnostycznych do identyfikacji kwarantannowego nicienia węgorka sosnowca, obowiązujących we wszystkich krajach Europy.
Rys. 1. Wykrywanie nicieni w chrząszczach żerdzianki sosnówki na początku sezonu (czerwiec/lipiec) z sondą specyficzną dla B. mucronatus (A) i z sondą specyficzną dla B. xylophilus (B) (chrząszcze pozytywne – stwierdzenie występowania nicieni):
– kolor niebieski – B. mucronatus (izolat Mdz-01-hodowla laboratoryjna)
– kolor czerwony – B. xylophilus (izolat Pt670L- hodowla laboratoryjna)
– kolor zielony – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor pomarańczowy – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor czarny – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor brązowy – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor fioletowy – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor żółty – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor jasnoniebieski – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor popielaty – kontrola odczynnikowa.
Rys. 2. Wykrywanie nicieni w chrząszczach żerdzianki sosnówki na początku sezonu (czerwiec/lipiec) z sondą specyficzną dla B. mucronatus (A) i z sondą specyficzną dla B. xylophilus (B) (chrząszcze negatywne – brak występowania nicieni):
– kolor niebieski – B. mucronatus (izolat Mdz-01-hodowla laboratoryjna)
– kolor czerwony – B. xylophilus (izolat Pt670L- hodowla laboratoryjna)
– kolor zielony – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor pomarańczowy – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor czarny – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor brązowy – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor fioletowy – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor żółty – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor jasnoniebieski – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor popielaty – kontrola odczynnikowa.
Rys. 3. Wykrywanie nicieni w chrząszczach żerdzianki sosnówki na końcu sezonu (wrzesień/październik) z sondą specyficzną dla B. mucronatus (A) i z sondą specyficzną dla B. xylophilus (B) (chrząszcze negatywne – brak występowania nicieni):
– kolor niebieski – B. mucronatus (izolat Mdz-01-hodowla laboratoryjna)
– kolor czerwony – B. xylophilus (izolat Pt670L- hodowla laboratoryjna)
– kolor zielony – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor pomarańczowy – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor czarny – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor brązowy – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor fioletowy – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor żółty – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor jasnoniebieski – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor popielaty – kontrola odczynnikowa.
Rys. 4. Wykrywanie nicieni w chrząszczach żerdzianki sosnówki na końcu sezonu (wrzesień/październik) z sondą specyficzną dla B. mucronatus (A) i z sondą specyficzną dla B. xylophilus (B) (chrząszcze negatywne – brak występowania nicieni):
– kolor niebieski – B. mucronatus (izolat Mdz-01-hodowla laboratoryjna)
– kolor czerwony – B. xylophilus (izolat Pt670L- hodowla laboratoryjna)
– kolor zielony – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor pomarańczowy – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor czarny – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor różowy – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor brązowy – analiza chrząszcza pod kątem obecności nicieni
– kolor popielaty – kontrola odczynnikowa.
PUBLIKACJA:
Filipiak A., Tomalak M. (2024). Real-time PCR as a tool for detection and identification of Bursaphelenchus xylophilus and B. mucronatus based on trace amounts of their DNA left in the vector – the pine sawyer beetle, Monochamus galloprovincialis. Journal of Applied Entomology 2024, 1–9. https://doi.org/10.1111/jen.13358.
2. Naturalna hybrydyzacja wewnątrz-gatunkowa zachodząca w drzewostanach sosnowych pomiędzy populacjami Bursaphelenchus mucronatus prezentującymi genotyp europejski i wschodnioazjatycki
W bieżącym roku sfinalizowano badania nad zmiennością genetyczną rodzimych, związanych z sosną populacji nieszkodliwego nicienia Bursaphelenchus mucronatus, który spośród ok. 130 znanych na świecie (w tym 24 występujących w Polsce) gatunków z rodzaju Bursaphelenchus jest morfologicznie, genetycznie i bionomicznie najbardziej zbliżony do kwarantannowego nicienia węgorka sosnowca (Bursaphelenchus xylophilus). Te dwa gatunki mogą równocześnie zasiedlać te same regiony geograficzne, drzewostany i pojedyncze drzewa. W procesie rozprzestrzeniania się wykorzystują te same gatunki owadów-wektorów. W Europie jest to głównie powszechna w drzewostanach sosnowych żerdzianka sosnówka (Monochamus galloprovincialis) i okazjonalnie tycz mniejszy (Acanthocinus griseus). B. mucronatus i B. xylophilus mogą również skutecznie konkurować, a w niektórych kombinacjach izolatów/szczepów rodzicielskich krzyżować się oraz tworzyć żywotne i płodne potomstwo hybryd w wielu pokoleniach potomnych.
Nicień Bursaphelenchus mucronatus Mamiya & Enda, 1979 jest gatunkiem szeroko rozprzestrzenionym w drzewostanach iglastych Palearktyki (tj. Europy i Azji). Dotychczas, wyróżniono dwa jego podgatunki, tj. B. mucronatus mucronatus i B. mucronatus kolymensis, które prezentują molekularnie różniące się genotypy, nazwane odpowiednio wschodnioazjatyckim i europejskim. Podgatunki te mogą również różnić się morfologicznie (kształt ogona samicy, lokalizacja poru wydalniczego), lecz cechy te wykazują znaczną, częściowo nakładającą się zmienność, co ogranicza wiarygodność odróżniania tych podgatunków wyłącznie na podstawie morfologii. Wschodnioazjatycki podgatunek występuje głównie na obszarach wschodniej Azji (Japonia, Chiny, Tajwan, Korea Pd.), europejski, zaś, w Europie i na Syberii. Jednakże, lokalne populacje obu tych podgatunków były izolowane z różnych rejonów zarówno Europy, jak i Azji. Prawdopodobną przyczyną tego zjawiska może być przypadkowa transmisja nicieni i/lub ich owadów-wektorów w wyniku międzynarodowego handlu drewnem.
Nasze morfologiczne i molekularne (DNA ITS-RFLP i okazjonalnie sekwencjonowanie) analizy prób drewna sosny oraz chrząszczy żerdzianki sosnówki, pochodzących z różnych rejonów Polski wykazały, że spośród 21 ostatnio izolowanych populacji B. mucronatus tylko 4 prezentowały typowe, znane dotychczas genotypy, tj. 2x wschodnioazjatycki (RsaI: 486, 412, 12 bp) i 2x europejski (RsaI: 413, 263, 227, 22 bp). Pozostałych 17 populacji prezentowało genotyp pośredni (RsaI: 413, 263, 227, 22 bp) i częściowo fenotypy pośrednie pomiędzy tymi podgatunkami. Wyrażało się to w odmiennej konfiguracji prążków separacji elektroforetycznej DNA otrzymanych dla poszczególnych populacji na drodze analizy molekularnej DNA ITS-RFLP (Rys. 5). Uzyskane wyniki wykazały w populacjach pośrednich obecność materiału genetycznego pochodzącego zarówno od podgatunku wschodnioazjatyckiego, jak i europejskiego. Sugeruje to wcześniejsze, krzyżowanie obu tych podgatunków na stanowiskach na których znalazły się one równocześnie (np. przypadkowe zawleczenie podgatunku wschodnioazjatyckiego do Europy).
Tabl. 1. Wykorzystane w badaniach izolaty i szczepy Bursaphelenchus mucronatus
L.p. Nadleśnictwo Izolat/szczep Genotyp
Nowe izolaty
01. Bielsk – Piliki Bie-01 pośredni
02. Chotyłów – Terespol Cht-01 pośredni
03. Gostynin – Duninów Gos-01 pośredni
04. Gubin – Borek Bor-01 pośredni
05. Kampinoski Park Narodowy – Lipków Kam-01 wschodnioazjatycki
06. Międzychód – Przedlesie Mdz-01 pośredni
07. Nowa Sól – Nowa Sól Nso-01 pośredni
08. Nowa Sól – Jarogniewice Nso-02 pośredni
09. Olsztyn – las miejski Ols-01 europejski
10. Pieńsk – Bielawa Pie-01 pośredni
11. Pniewy – Lwówek Lwo-01 pośredni
12. Pniewy – Lwówek Lwo-02 pośredni
13. Pniewy – Lwówek Lwo-03 europejski
14. Radzyń Podlaski – Kock Rad-03 wschodnioazjatycki
15. Oborniki – Kiszewko Kis-01 pośredni
16. Oborniki – Kiszewo Kis-02 pośredni
17. Oborniki – Bębnikąt Beb-01 pośredni
18. Oborniki – Bębnikąt Beb-02 pośredni
19. Wronki – Mokrz Wro-02 pośredni
20. Wronki – Mokrz Wro-03 pośredni
21. Zdrojowa Góra – Stobno Zdg-01 pośredni
Szczepy
22. Białoruś – 01 BEL-01 wschodnioazjatycki
25. Białoruś – 02 BEL-02 pośredni
23. Ukraina – 02 UKR-02 wschodnioazjatycki
24. USA DE-04 europejski
Rys. 5. Profile DNA ITS-RFLP naturalnych populacji Bursaphelenchus mucronatus izolowanych z prób drewna sosny zasiedlonego przez żerdziankę sosnówkę (Monochamus galloprovincialis). Izolowane nicienie prezentowały genotypy: europejski (A-B), wschodnioazjatycki (C-D), lub pośredni (E-M). M = DNA marker (MassRuler™ Low Range DNA Ladder, Thermo Fisher Scientific). Kolumna: 1 = rDNA produkt amplifikacji; Kolumny 2–6 = fragmenty restrykcyjne: Kolumna 2 = RsaI; Kolumna 3 = HaeIII; Kolumna 4 = MspI; Kolumna 5 = Hinf I; Kolumna 6 = AluI.
W celu eksperymentalnego potwierdzenia przyczyn obserwowanych zjawisk przeprowadzono serię indywidualnych krzyżowań wewnątrzgatunkowych in vitro, na standardowym podłożu Botrytis cinerea/PDA, pomiędzy osobnikami wybranych populacji B. mucronatus, prezentujących genotypy: europejski, wschodnioazjatycki i pośredni. Badaniami objęto 6 wariantów krzyżówek (Tabl. 2; Rys. 6.), a uzyskane populacje potomne (F2) poddano szczegółowej analizie DNA ITS-RFLP.
Tabl. 2. Porównanie genotypów rodzicielskich i ich potomstwa pokolenia F2 uzyskanego z indywidualnych krzyżówek wewnątrzgatunkowych osobników różnych populacji Bursaphelenchus mucronatus, prezentujących genotypy: wschodnioazjatycki, europejski i pośredni.
|
|
Genotypy rodzicielskie |
Genotyp pokolenia F2 |
|
1. |
wschodnioazjatycki x wschodnioazjatycki |
wschodnioazjatycki |
|
2. |
europejski x europejski |
europejski |
|
3. |
wschodnioazjatycki x europejski |
pośredni |
|
4. |
wschodnioazjatycki x pośredni |
pośredni |
|
5. |
europejski x pośredni |
pośredni |
|
6. |
pośredni x pośredni |
pośredni |
Rys. 6. Profile elektroforetyczne DNA ITS-RFLP wewnątrzgatunkowych hybryd Bursaphelenchus mucronatus, uzyskanych z indywidualnego (1:1) krzyżowania pomiędzy wybranymi naturalnymi izolatami tego nicienia, in vitro. Otrzymane, potomne pokolenie nicieni prezentowało genotypy: europejski (A), wschodnioazjatycki (B), lub pośredni (C-F). M = DNA marker (MassRuler™ Low Range DNA Ladder, Thermo Fisher Scientific). Kolumna: 1 = rDNA produkt amplifikacji; Kolumny 2–6 = fragmenty restrykcyjne: Kolumna 2 = RsaI; Kolumna 3 = HaeIII; Kolumna 4 = MspI; Kolumna 5 = Hinf I; Kolumna 6 = AluI.
Nasze badania terenowe w drzewostanach sosnowych wykazały, że na obszarze Polski występuje zarówno europejski, jak i wschodnioazjatycki podgatunek niepatogenicznego nicienia Bursaphelenchus mucronatus. Wykazały one również powszechną obecność populacji prezentujących genotyp i częściowo fenotyp pośredni pomiędzy tymi podgatunkami.
Wyniki indywidualnego krzyżowania wewnątrzgatunkowego in vitro pomiędzy odrębnymi populacjami B. mucronatus, wsparte szczegółowymi badaniami molekularnymi (DNA ITS-RFLP) wykazały, że wykryte w drzewostanach sosnowych Polski izolaty tego nicienia, reprezentujące genotyp pośredni powstały na drodze spontanicznej hybrydyzacji pomiędzy sąsiadującymi populacjami o znanych dotychczas genotypach: europejskim i wschodnioazjatyckim. Osobniki o nowym genotypie pośrednim zawierają materiał genetyczny obu populacji rodzicielskich.
Powstające osobniki hybryd krzyżujące się wstecznie z osobnikami o genotypach rodzicielskich, lub z osobnikami innych populacji o genotypie pośrednim zawsze tworzyły genotyp pośredni. Sugeruje to, że nowy, rozszerzony genotyp może pozostawać w populacji hybryd przez wiele pokoleń następczych.
Każda hybrydyzacja z udziałem osobników/populacji prezentujących odmienne genotypy rozszerza różnorodność genetyczną w populacjach potomnych. Zwiększa w ten w ten sposób możliwości powstawania nowych fenotypów, które mogą być odpowiedzialne za istotne funkcje biologiczne organizmu. W przypadku omawianego gatunku B. mucronatus, podobnie, jak i patogenicznego węgorka sosnowca wyjaśnienie konsekwencji rozszerzenia zmienności genetycznej wymaga dalszych, szczegółowych badań. Jednakże, obserwowane już obecnie przez wielu autorów zróżnicowanie zdolności odrębnych populacji B. mucronatus do międzygatunkowego krzyżowania się z B. xylophilus wskazuje, że zmienność taka może mieć istotne znaczenie praktyczne. Zwiększona skuteczność krzyżowań pomiędzy tymi gatunkami wraz z potencjalnym powstawaniem i przekazywaniem ważnych, adaptacyjnych cech funkcjonalnych (np. patogeniczności w stosunku do sosny; zwiększonej zdolności rozwoju w niższych temperatur środowiska, reprodukcji, czy zdolności zasiedlania owada-wektora) może prowadzić do wzrostu realnego zagrożenia dla drzewostanów sosnowych w przypadku zadomowienia się B. xylophilus na centralnych i północnych obszarach Europy.
PUBLIKACJA:
Tomalak, M., Filipiak, A. (2024). A natural intra-specific hybridization between populations of B. mucronatus with European and East Asian genotypes, in pine forests. Forest Pathology, 54, e12868. https://doi.org/10.1111/efp.12868
Projekt realizowany w ramach Dotacji Celowej MRIRW na 2023
Obszar 1: Ochrona roślin oraz ograniczanie zagrożeń związanych z rozprzestrzenianiem się organizmów kwarantannowych i stosowaniem
środków ochrony roślin.
Zadanie 1.3: Prowadzenie internetowej Platformy Sygnalizacji Agrofagów
Instytut Ochrony Roślin - Państwowy Instytut Badawczy
Ulica: Władysława Węgorka 20
60-318 Poznań
tel. +48 61 864 90 75
fax +48 61 864 91 20
Instytut Ochrony Roślin - Państwowy Instytut Badawczy
Internetowy System Sygnalizacji Agrofagów
